参见:最后生还者角色列表

游戏中主角横跨美国的路线

遊戲開場設定於2013年的美國,主角喬爾是一個單身父親,與他12歲的女兒莎拉住在德克薩斯州。一天晚上,突變的蟲草菌肆虐美國,病菌將其人類宿主變成攻擊性強且吃人的怪物。喬爾與他的弟弟湯米和莎拉逃離混亂,但莎拉却被一名士兵槍殺。

20年後,人類文明已面目全非,倖存者生活在治安隔離區。住在波士頓隔離區的喬爾與他的朋友泰絲向當地黑幫追討原本應該給他們的武器,這批武器卻被賣給了地下組織火螢。喬爾和泰絲得知真相後殺了那個無賴,卻遇上了火螢的首領瑪琳。瑪琳提出只要他們能將一個14歲的小女孩艾莉,送到議會大廈給火螢護送部隊接手,就同意把武器還給他們。雖然當下未說明,但護送期間艾莉坦承三個星期前被感染,卻活了下來,她被認為可能擁有研製疫苗的關鍵。抵達大廈後議會被士兵包圍,因稍早襲擊而遭到真菌感染的泰絲於是決定犧牲自己為兩人拖延時間,並要求喬爾將艾莉送達火螢的手中。

游戏中虚构团体“火萤”的标志

乔尔决定和艾莉去找汤米,他知道火螢的下落。在林肯的朋友比尔的帮助下,他们获得了一辆车。但开车到匹兹堡時,他们被當地武裝猎人伏击。他们与兄弟亨利和山姆成为同伴,一同逃离城市。但逃離當夜山姆因被咬伤變異成感染者,亨利杀死山姆后悲傷不已而自杀。

到了秋天,乔尔和艾莉终于在怀俄明州找到汤米,其控制一座水壩。乔尔本考慮由湯米接手艾莉,但最後仍繼續和她待在一起。汤米告訴他们實驗室位於废弃的东科罗拉多大学,但他們抵達時火螢早已经撤離至盐湖城的聖瑪麗医院。当他们打算离开时遭猎人袭击,最后艾莉带着腹部重伤的乔尔逃离。

時間進入冬季,艾莉和乔尔暂住在山上的廢棄度假村,乔尔意識不清,需要艾莉的照顾。在猎取一隻公鹿时,艾莉遇到大卫和詹姆斯,她从他们手中换得了药品以治療喬爾,但二人其实是食人族(Cannibals),他们跟蹤並抓走了艾莉。她逃脫時杀死了詹姆斯,但是大衛因為中意艾莉而不想殺了她,想讓她在食人族待下來。同時略微恢复的乔尔到处寻找艾莉並發現獵人的蹤跡,同時間,艾莉在逃脫時差點被大衛杀掉。最後艾莉反杀了大卫,喬爾隨後也找到了她,兩人一起逃离。

春天,乔尔和艾莉抵达盐湖城,被火螢捕获。在医院里,马琳告诉乔尔,他们必需给艾莉做脑部手术以研制疫苗,艾莉将为此付出生命。但乔尔不願讓艾莉去死,於是救下了手术室中昏睡中的艾莉逃出醫院,顺手杀死了马琳並回到湯米的據點生活。路上艾莉醒來後乔尔向艾莉謊稱世界上有數十人和艾莉一樣對蟲草菌免疫,而且火螢雖然找到這些免疫者卻根本無法找出治愈蟲草菌的方法。艾莉將信將疑,乔尔對艾莉發誓表示自己所說的都是真的。

游戏还提供了下载内容《最後生還者:拋諸腦後》互相穿插了两部剧情:在逃离东科罗拉多大学后,重伤的乔尔急需治疗,艾莉为了救他独自冒险前往废弃的购物中心,并从坠落的军队直升机裡拾获了宝贵的的急救箱;以及本篇故事发生前(艾莉的回憶),艾莉和好友萊莉最後一次的冒險。萊莉加入了火螢,她与艾莉来到一个废弃的购物中心,告诉艾莉她已被部署到另一城市。艾莉求她留下来。其後她们遭到感染者的追赶,并都被咬伤。两人考虑一起等待死亡,但最终决定度过最后的时刻。